Ezio ist zurück. Besser als jemals zuvor nimmt er den Kampf gegen die Templer wieder auf. Als meisterhafter Assassine reist er nach Rom, dem von Gier und Korruption durchzogenen Machtzentrum seiner Gegner. Doch die Stärke eines einzigen Mannes reicht dieses Mal nicht aus, um gegen die Feinde zu bestehen. Nur mit der Bruderschaft an seiner Seite kann Ezio die korrupten Tyrannen besiegen, die sich in der Stadt verschanzt haben. Daher muss Ezio seine Führungsqualitäten beim Befehligen der Bruderschaft beweisen. Wenn sie wie ein Mann zusammenstehen, können die Assassinen ihre Todfeinde vernichten. Assassin's Creed Brotherhood bietet zum ersten Mal in der Geschichte der Reihe einen Mehrspieler-Modus. Mit Hilfe von Abstergo trainieren die Spieler ihre Kampfkünste. So unterstützen sie die Templer bei der endgültigen Vernichtung der Assassinen. Hierfür stehen unterschiedliche Klassen zur Auswahl, die sich in ihren Waffen und Assassinen-Fertigkeiten voneinander unterscheiden. Der Mehrspieler-Modus wird verschiedene Spielmodi beinhalten, in denen sich Spieler aus aller Welt miteinander messen können.